Διεθνές Έτος Χημείας 2011

Οι πρόσφατες σημαντικές ανακαλύψεις στη βιολογία των βλαστοκυττάρων έχουν δημιουργήσει ενθουσιασμό για τις θεραπευτικές πορείες στην επισκευή ή/και στην αναγέννηση ιστών και οργάνων [1]. Οι ανακαλύψεις αυτές περιλαμβάνουν γνώσεις σχετικά με τους μηχανισμούς που ρυθμίζουν την τύχη των εμβρυϊκών και των ενήλικων βλαστοκυττάρων.

Άλλες πρόσφατες εξελίξεις περιλαμβάνουν την ικανότητα χειραγώγησης και ελέγχου της μοίρας των βλαστοκυττάρων, τη λειτουργία τους με έναν πιο ακριβή και καθορισμένο τρόπο και τον επαναπρογραμματισμό γενεαλογικά συνδεδεμένων κυττάρων, ώστε να επανέλθουν σε πιο πρόγονες-πολλαπλές καταστάσεις, όπου τα κύτταρα μπορούν να σχηματίσουν πολλούς τύπους κυττάρων ή ακόμη και σε πολυδύναμες καταστάσεις, όπου τα κύτταρα μπορούν να σχηματίσουν όλους τους τύπους κυττάρων του σώματος.

Εκτός ότι τα διάφορα είδη των βλαστοκυττάρων είναι εξαιρετικά μοντέλα για τη μελέτη της ανθρώπινης βιολογίας της ανάπτυξης και των ασθενειών, παρέχουν επίσης σπουδαία βοήθεια σε σύγκριση με τις συμβατικές κυτταρικές σειρές για την ανακάλυψη φαρμάκων (τη προσομοίωση κάποιας νόσου και την επικύρωση των πρωτεϊνών στόχων).

Επιπλέον τα βλαστοκύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να αντικαταστήσουν κύτταρα που έχουν υποστεί βλάβη λόγω ασθενειών και τραυματισμών, καθώς και να γίνουν ενδογενείς στόχοι για συμβατικά μικρά μόρια ή για βιολογικές θεραπείες που διεγείρουν τα κύτταρα ενός οργανισμού για αναπαραγωγή in vivo.

Χημικές προσεγγίσεις και μικρά μόρια αποτελούν το κλειδί για πολλές βιολογικές ανακαλύψεις. Η κατανόηση του βιολογικού φαινόμενου συχνά ξεκινά με την παρατήρηση του και συνεχίζει με την ανακάλυψη και τον σχεδιασμό τρόπων διατάραξης και μελέτης του. Αν και οι γενετικές μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για τον παραπάνω σκοπό, η χημική προσέγγιση φέρει περισσότερα πλεονεκτήματα.

Για παράδειγμα, τα μικρά μόρια προσφέρουν συνήθως χρονικό έλεγχο της λειτουργίας των πρωτεϊνών σε υψηλό βαθμό προκαλώντας ταχεία αναστολή ή ενεργοποίηση και συχνά με αναστρέψιμα αποτελέσματα. Οι επιπτώσεις τους μπορούν επίσης να είναι εξαιρετικά εξαρτώμενες από τη μεταβολή των συγκεντρώσεων τους. Επιπλέον, ένα και μόνο μικρό μόριο μπορεί να διαμορφώνει ταυτόχρονα πολλαπλούς συγκεκριμένους στόχους μέσα σε μια οικογένεια πρωτεΐνης ή σε διαφορετικές οικογένειες πρωτεϊνών. Αυτό επιτρέπει την παραγωγή ενός επιθυμητού φαινοτύπου με ένα συνεργιστικά ευνοϊκό τρόπο.

Βιολογικός έλεγχος μικρών μορίων

Για τον βιολογικό έλεγχο μικρών μορίων μπορούν να δημιουργηθούν βιβλιοθήκες με βάση τη βιολογική τους ικανότητα και τη μοριακή τους ποικιλομορφία.

Ο έλεγχος ως προς ένα συγκεκριμένο μοριακό στόχο εκμεταλλεύεται συνήθως τη λειτουργία μιας πρωτεΐνης (για παράδειγμα, ενζυμική δραστικότητα ή μετάδοση σήματος) ή μοριακές αλληλεπιδράσεις.

Οι έλεγχοι φαινοτύπου είναι σημαντικοί, διότι δεν απαιτείται προγενέστερη γνώση των καθορισμένων στόχων και μηχανισμών για τον συγκεκριμένο επιθυμητό φαινότυπο.

Οι εν λόγω έλεγχοι μπορούν να πραγματοποιηθούν σε κύτταρα ή και σε ολόκληρους οργανισμούς μέσω εξέτασης πολλαπλών δεικτών και λειτουργικών αλλαγών (για παράδειγμα της μορφολογίας των κυττάρων και της συμπεριφοράς) με τη χρήση αυτοματοποιημένων τεχνολογιών υψηλής ανάλυσης στην απεικόνιση.

Αρχικά οι ενώσεις προσδιορίζονται από έναν πρωτογενή έλεγχο και στη συνέχεια επιβεβαιώνονται με τη χρήση μιας σειράς δευτερευουσών αναλύσεων.

Η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος για τον εντοπισμό των μοριακών στόχων και των μονοπατιών μιας άγνωστης ένωσης, είναι η χρωματογραφία συγγένειας με επισημασμένες ενώσεις σε συνδυασμό με τη φασματομετρία μάζας.

Οι πρωτεΐνες-στόχοι τυπικά επικυρώνονται από μελέτες ανάκτησης και απώλειας λειτουργίας (για παράδειγμα, μέσω ανάλυσης μικροσυστοιχιών (microarray) και παρεμβολής RNA) για να επιβεβαιωθεί η δραστικότητα της ένωσης, καθώς και με τη χρήση άλλων σχετικών βιοχημικών και κυτταρικών προσδιορισμών (χημική και γενετική αλληλοσυμπληρωματικότητα).

Παραδείγματα μικρών μορίων που επηρεάζουν την μοίρα των κυττάρων

Υπάρχουν πολλά παραδείγματα μικρών μορίων συνθετικών ή φυσικών προϊόντων που ρυθμίζουν έναν ή πολλαπλούς στόχους και επηρεάζουν την μοίρα των κυττάρων.

Αυτά μπορεί να συνδέονται με πυρηνικούς υποδοχείς (π.χ. all-trans ρετινοϊκό οξύ, δεξαμεθαζόνη), με ένζυμα που τροποποιούν τις ιστόνες και το DNA (π.χ τριχοστατίνη Α, BIX 01294, 5-αζακυτιδίνη), ή να παρεμβάλλονται σε σηματοδοτικές οδούς (π.χ ρεβερσίνη, πουρμορφαμίνη, 16,16 διμεθυλοπροσταγλανδίνη Ε2, φορσκολίνη, QS11, ΒΙΟ, κυκλωπαμίνη, νευροπαθιαζόλιο, πλουριποτίνη και Υ-27632).

Οι παραπάνω χημικές ουσίες έχουν χρησιμοποιηθεί για να ρυθμίζουν και να διαφοροποιούν φαινοτύπους βλαστοκυττάρων και μπορούν να παίξουν κάποιο ρόλο στη θεραπεία ασθενειών που βασίζονται σε πρόγονα βλαστοκύτταρα, όπως ορισμένους τύπους καρκίνου.

Παραδείγματα μικρών μορίων που ρυθμίζουν την μοίρα των κυττάρων.

Θεραπευτικές στρατηγικές

Η δράση των μικρών μορίων στις θεραπευτικές στρατηγικές για την αναγεννητική ιατρική είναι ποικίλη όπως απεικονίζεται σχηματικά.

Α. Τα μικρά μόρια μπορούν να στοχεύσουν βλαστοκύτταρα ή πρόγονα κύτταρα για αυτο-αναγέννηση (a) ή διαφοροποίηση (b). Τα μικρά μόρια μπορούν να στοχεύσουν επίσης διαφοροποιημένα κύτταρα (lineage-restricted cells) για παραγωγή πιο πρόγονων κυττάρων ή άλλους τύπους κυττάρων των ιστών (c), ή μπορούν να ρυθμίσουν την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό, ή τον επαναπρογραμματισμό των τελικά διαφοροποιημένων κυττάρων (d). Μπορούν να ελέγξουν τη μοίρα των κυττάρων και/ή τη λειτουργία των κυττάρων-στόχων μέσω ρύθμισης των κατάλληλων κυτταρικών «φωλιών» (e).

Β. Ομογενείς και λειτουργικοί τύποι κυττάρων που παράγονται σε χημικά καθορισμένες συνθήκες μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για θεραπεία. Εναλλακτικά, συμβατικές χημικές και βιολογικές θεραπείες μπορούν να αναπτυχθούν στοχευμένα σε κύτταρα ασθενών ή «φωλιών» με σκοπό την αναγέννηση in vivo.

Θεραπευτικές στρατηγικές στην αναγεννησιακή ιατρική.

Ενα από τα πιο χαρακτηριστικά παραδείγματα μικρών μορίων που επηρεάζουν την μοίρα των κυττάρων είναι η κυκλωπαμίνη, ένα φυσικό προϊόν με γοητευτική ιστορία. Η κυκλωπαμίνη είναι ο πρώτος ταυτοποιημένος αναστολέας του hedgehog (σκαντζόχοιρος) σηματοδοτικού μονοπατιού και η ιστορία της είναι στενά συνδεδεμένη με την πρόοδο στο πεδίο της εφαρμογής μικρών μορίων στην βιολογία των κυττάρων και την αναγεννησιακή ιατρική.

Στα τέλη της δεκαετίας του '70 oι C. Nüsslein-Volhard και E.F. Wieschaus μελέτησαν μεταλλάξεις της μύγας των φρούτων Drosophila melanogaster και εντόπισαν περισσότερα από 50 διαφορετικά γονίδια που είχαν άμεση επίδραση στην εμβρυϊκή ανάπτυξη.

Ένα από αυτά τα γονίδια, όταν ήταν μεταλλαγμένο, προκαλούσε την ανάπτυξη ενός στρώματος αγκαθιών στην κάτω πλευρά των προνυμφών. Η ομοιότητα στην εμφάνιση αυτών των προνυμφών με ένα σκαντζόχοιρο οδήγησε στον όρο hedgehog-gene (γονίδιο-σκαντζόχοιρος),(hh) [2].

Για την έρευνά τους αυτή που αποτελεί ορόσημο στον τομέα της γενετικής της ανάπτυξης του εμβρύου, οι Nüsslein-Volhard και Wieschaus μαζί με τον E.B. Lewis βραβεύτηκαν με το Νόμπελ Ιατρικής το 1995 [3]. Το 1993 τρία γονίδια εντοπίστηκαν σε σπονδυλωτά και ονομάστηκαν Sonic hh (Shh), από τον ήρωα βίντεο παιχνιδιού της Sega, Ιndian hh (Ιhh) και Desert hh (Dhh).

Τα τρία γονίδια που προέρχονται από τη μύγα των φρούτων, θεωρούνται ως βασικοί ρυθμιστές της εμβρυϊκής ανάπτυξης για τον άνθρωπο. Αυτά ρυθμίζουν διαδικασίες όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και τον σχηματισμό ιστού.

Ενώ στα έντομα οι πρωτεΐνες hh ελέγχουν τη σωστή κατάτμηση και την ανάπτυξη των φτερών τους, στα σπονδυλωτά προκαλούν την ασυμμετρία αριστερής-δεξιάς πλευράς και επηρεάζουν την ορθή διαμόρφωση των άκρων, του σκελετού, των μυών, του δέρματος, των ματιών, των πνευμόνων, των δοντιών, του νευρικού συστήματος, του εντέρου και τη διαφοροποίηση του σπέρματος και του χόνδρου. Στους ενήλικες οργανισμούς αυτό το μονοπάτι έχει σημαντικές λειτουργίες στη συντήρηση των βλαστοκυττάρων, καθώς και στην επιδιόρθωση των ιστών και στην αναγέννηση.

Πρόσφατη έρευνα έχει αποκαλύψει και τη σκοτεινή πλευρά της hh σηματοδότησης. Στα θηλαστικά συνδέεται με την αιτιολογία του βασικοκυτταρικού καρκινώματος (BCC) και του μυελοβλαστώματος.

Επιπλέον, ο καρκίνος του παγκρέατος, του προστάτη, του πνεύμονα και του μαστού εξαρτώνται από τη δραστικότητα του σήματος hh. Η αναστολή της δραστικότητας του μονοπατιού hh από μικρά μόρια έχει οδηγήσει ως εκ τούτου σε νέες θεραπευτικές στρατηγικές. Σε αντίθετη περίπτωση, ενεργοποιητές του μονοπατιού hh μπορούν να βρουν εφαρμογές ως επαγωγείς της αγγειογένεσης, της επούλωσης πληγών και ως πολύτιμα εργαλεία στον τομέα της έρευνας των βλαστοκυττάρων [4].

Κατά τη διάρκεια της έρευνας του μονοπατιού hh στη δεκαετία του '90, o Beachy και οι συνεργάτες του αναζήτησαν έναν απλό τρόπο για τη μελέτη αυτής της οδού, που να μη συμπεριλαμβάνει αφαίρεση γονιδίου, μια εργασία δύσκολη και χρονοβόρα για εκτέλεση. Η χρήση μικρών μορίων όπως βιοχημικοί ανιχνευτές παρουσίασε μια πιο εύκολη και γρήγορη εναλλακτική λύση. Ωστόσο, κανένα μόριο που ήταν σε θέση να επηρεάσει την hh σηματοδότηση δεν ήταν γνωστό εκείνη τη στιγμή.

Ο Beachy και οι συνεργάτες του κατάφεραν να συνδυάσουν τις γνώσεις τους σχετικά με τη hh σηματοδότηση με ένα εκ πρώτης όψεως διαφορετικό επιστημονικό πεδίο για να λύσουν αυτό το πρόβλημα. Θυμήθηκαν ένα περίεργο περιστατικό στη δεκαετία του '50 στο Idaho. Στη δεκαετία μετά τον Δεύτερο Παγκόσμιο Πόλεμο μια τυχαία παρτίδα αμνών σε κοπάδια προβάτων γεννήθηκε με σοβαρές κρανιοφασικές ανωμαλίες. Έως 25% των νεογέννητων αμνών στα βουνά του κεντρικού Idaho επηρεάστηκαν.

Η σοβαρότητα αυτής της δυσμορφίας που ονομάζεται ολοπροσεγκεφαλία κυμαινόταν από την ακραία μορφή του κυκλωπισμού, δηλαδή την ύπαρξη μόνο του ενός ματιού στο μέτωπο η οποία συνοδεύεται με δυσπλασίες του εγκεφάλου, μέχρι και ελαφρώς συντομευμένη άνω γνάθο. Οι πιο σοβαρές δυσπλασίες περιλαμβάνουν, επίσης, εν μέρει ή εξ ολοκλήρου αδιαίρετα εγκεφαλικά ημισφαίρια, οσφρητικά και οπτικά νεύρα.

Μετά από εντατική έρευνα επί τρία έτη η δυσπλασία αυτή αποδόθηκε στην κατανάλωση του φυτού Veratrum californicum κατά τη διάρκεια της κύησης των προβάτων. Έτσι αναπτύχθηκε μια μέθοδος εκχύλισης, η οποία επέτρεψε την απομόνωση των αλκαλοειδών της Veratrum californicum και τη διερεύνηση της δυνατότητάς τους να προκαλέσουν κυκλωπισμό σε έμβρυα.

Αποδείχθηκε ότι μόνο τρεις ενώσεις κατέχουν αυτή την ικανότητα, το γνωστό αλκαλοειδές γερβίνη, η κυκλωποσίνη (η 3-γλυκοσυλιωμένη κυκλωπαμίνη) και μια τρίτη πιο ενεργή, το στεροειδές αλκαλοειδές που ονομάστηκε κυκλωπαμίνη [5].

Αλκαλοειδή του φυτού Veratrum californicum

Μετά από επισταμένες μελέτες διευκρινίστηκε από τον Beachy και τους συνεργάτες του η δράση της κυκλωπαμίνης στο hh μονοπάτι και έγινε δεκτό ότι η κυκλωπαμίνη αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη Smo, προκαλεί συσσώρευση της στα πρωτογενή cilium (προεξοχές της κυτταρικής μεβράνης) και αναστέλλει τη δραστικότητα της μέσω αλλαγής της διαμόρφωσης της σε μια κλειστή μορφή [6].

Πρόσφατα, ο Giannis και οι συνεργάτες του πέτυχαν μια βιομιμητική σύνθεση της κυκλωπαμίνης, ξεκινώντας από την εμπορικά διαθέσιμη δεϋδροεπιανδροστερόνη. Η νέα αυτή προσέγγιση θα διευκολύνει τη σύνθεση ανταγωνιστών Smo με βάση την κυκλωπαμίνη και επιπλέον θα επιτρέψει βαθύτερες γνώσεις στη σχέση δομής-δραστικότητας [7,8].

Σύνθεση κυκλωπαμίνης

Ο καρκίνος του παγκρέατος αποτελεί την τέταρτη πιο συχνή αιτία καρκίνου που σχετίζεται με τη θνησιμότητα τόσο στις γυναίκες όσο και στους άνδρες στις ΗΠΑ. Στα μεταστατικά στάδια, ο καρκίνος του παγκρέατος δε μπορεί σχεδόν ποτέ να ελεγχθεί μέσω κάποιου από τα διαθέσιμα φάρμακα και η πενταετής επιβίωση υπολογίζεται να είναι μικρότερη του 2%. Ακόμη και σε περιπτώσεις σε πρώιμο στάδιο, όπου η χειρουργική επέμβαση μπορεί να γίνει, η πλειονότητα των ασθενών αναπτύσσουν τοπική υποτροπή ή μεταστάσεις σε απομακρυσμένα όργανα.

Έντονες προσπάθειες έχουν αναληφθεί τα τελευταία χρόνια για την ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών που αφορούν άμεσα την εξάπλωση των μεταστατικών όγκων και αναμένεται ότι οι στρατηγικές αυτές θα έχουν τεράστιες κλινικές επιπτώσεις. Πρόσφατα, μια μελέτη προσδιόρισε το μονοπάτι hh ως μία από τις βασικές οδούς σηματοδότησης που οδηγεί σε αλλαγές σε όλα σχεδόν τα παγκρεατικά κύτταρα.

Η αναστολή της hh σηματοδότησης μέσω της κυκλωπαμίνης έχει ενισχύσει το ποσοστό επιβίωσης σε γενετικά τροποποιημένα ποντίκια με καρκίνο του παγκρέατος. Αυτή η μελέτη παρέχει επίσης στοιχεία ότι hh σηματοδότηση είναι ένας έγκυρος στόχος για την ανάπτυξη καινοτόμων θεραπειών για τον καρκίνο του παγκρέατος και αξίζει να αξιολογηθεί σε κλινικό περιβάλλον.

Το βασικο κυτταρικό καρκίνωμα είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου του δέρματος στις ΗΠΑ. Αυτή η ασθένεια έχει μια εκτιμώμενη ετήσια επίπτωση της τάξης του 0,1-0,5% και προκαλείται σε μεγάλο βαθμό από την έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία. Η χειρουργική επέμβαση θεραπεύει τις περισσότερες περιπτώσεις του βασικοκυτταρικού καρκινώματος, αλλά σε μερικούς ασθενείς π.χ. με τοπικά προχωρημένους ή μεταστατικούς όγκους δε μπορεί να εφαρμοστεί.

Αναστολείς του μονοπατιού hh αποτελούν πολύτιμες στρατηγικές για τη θεραπεία αυτού του τύπου καρκίνου. Μια κρέμα που περιείχε την κυκλωπαμίνη δόθηκε σε ασθενείς που είχαν τον παραπάνω τύπο καρκίνου. Η ιστολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξαν αναστολή του πολλαπλασιασμού και αυξημένη επαγωγή της διαφοροποίησης και της απόπτωσης των κυττάρων του όγκου.

Το μυελοβλάστωμα είναι ο πιο κοινός εμβρυικός όγκος σε παιδιά. Η μέση ηλικία διάγνωσης είναι τα πέντε έτη με το ηλικιακό φάσμα να εκτείνεται έως και την αρχή της ενηλικίωσης. Για τη θεραπεία του συνιστάται χειρουργική επέμβαση ακολουθούμενη από ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία με αυξημένο κίνδυνο σε σοβαρές βραχυπρόθεσμες και μακροχρόνιες δυσμενείς επιπτώσεις.

Ένας εικοσιεξάχρονος άντρας είχε μεταστατικό μυελοβλάστωμα που ήταν ανθεκτικό σε πολλές θεραπείες. Η θεραπεία με τη βοήθεια της κυκλωπαμίνης οδήγησε σε μια παροδική μείωση του όγκου και μια δραματική μείωση των συμπτωμάτων.

Ολοένα και περισσότερα συμβατικά μικρά μόρια προσελκύουν το ενδιαφέρον στην αναγεννησιακή ιατρική με στόχο την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και τον επαναπρογραμματισμό ενδογενών κυττάρων.

Η συνεχής ανάπτυξη και εφαρμογή της χημείας στα βλαστοκύτταρα είναι βέβαιο ότι θα οδηγήσει στην αναγνώριση πρόσθετων μικρών μορίων με μεγαλύτερη ακρίβεια ελέγχου της μοίρας των κυττάρων in vivo και in vitro και πιθανό στη θεραπεία πολλών ασθενειών.